Universiteit Stellenbosch
Welkom by Universiteit Stellenbosch
Die potensiaal van 'n nuwe terapeutiese middel vir die behandeling van Alzheimer se siekte
Outeur: Lize Engelbrecht
Gepubliseer: 17/08/2022

​Met die gebruik van gevorderde mikroskopietegnieke kon navorsers wys hoe 'n natuurlike poliamien, spermidien, behandelingstrategieë kan verbeter teen neurodegenerasie wat met Alzheimer se siekte geassosieer word.

Dr Dumisile Lumkwana, ook 'n voormalige ontleder by SAF Fluoressensie Microscopie eenheid, het tydens haar PhD van superresolusiemikroskopie en korrelatiewe lig- en elektronmikroskopie (CLEM) gebruik gemaak om die effekte van spermidien in neuronale selle waarin Alzheimer-verwante effekte geïnduseer is, te bestudeer. Hierdie werk is onlangs gepubliseer in die joernaal Frontiers in Cell and Developmental Biology (DOI:10.3389/fcell.2022.819571).

Sien grafika waarna in hierdie artikel verwys word in die CAF-jaarverslag.

Modelle vir Alzheimer se siekte

Tydens Alzheimer se siekte versamel sekere proteïene en aggregreer in neuronale selle, wat neurotoksisiteit veroorsaak. Een so 'n proteïen is amyloïed-voorloperproteïen (APP), wat op sy beurt lei tot die generering van die aggregaat-geneigde peptied amyloïed-beta. Deur gebruik te maak van selle wat geneties gemodifiseer is om buitensporige vlakke van APP en amiloïed-beta te produseer, boots die ophoping daarvan die proteïenophoping na wat met Alzheimer se siekte geassosieer word. Sommige omgewingsbesoedelende stowwe en landbouplaagdoders, soos parakwat, is neurotoksies en word ook met neurodegeneratiewe siektes geassosieer.

Onder toesig van prof Ben Loos van die Departement Fisiologiese Wetenskappe het dr Lumkwana die doeltreffendheid van spermidien ondersoek 1) in selle wat APP ooruitdruk, 2) in selle wat met parakwat behandel is en 3) in 'n muismodel waar neuronale skade deur parakwattoediening veroorsaak is.

Sellulêre lewensvatbaarheid is verminder met verloop van tyd in mutante neuronale selle wat APP ooruitdruk, terwyl spermidien die sellulêre lewensvatbaarheid oor tyd aansienlik verbeter het. Deur gebruik te maak van vloeisitometrie, uitgevoer deur dr Rozanne Adams, is daar ook getoon dat parakwat die lewensvatbaarheid van neuronale selle verminder en 'n beduidende toename in die produksie van reaktiewe suurstofspesies (ROS) in die selle veroorsaak het. Beide lae en hoë konsentrasies spermidien het sellewensvatbaarheid aansienlik verbeter, maar ROS-produksie is slegs verminder wanneer 'n lae konsentrasie spermidien gebruik is, wat daarop dui dat die effekte van spermidien konsentrasieafhanklik is en dienooreenkomstig ondersoek moet word. Hierdie resultate het getoon dat die gebruik van beide APP-ooruitdrukkingselle en selle wat aan parakwat-toksisiteit blootgestel is, ideaal was om die meganismes waardeur spermidien beskerming teen neurodegenerasie kan bied, te bestudeer.

Teiken die sellulêre skoonmaakproses

Een so 'n meganisme van werking kan wees deur die sellulêre proses genaamd outofagie, wat verantwoordelik is vir die verwydering van proteïenaggregate, giftige middels en ander beskadigde selinhoud. Tydens outofagie versamel vrag in vakuole in die sel en word daarna deur 'n proses van degradasie geneem. Eerstens word molekules in 'n fagofoor versamel, wat dan in 'n outofagosoom ontwikkel en uiteindelik met 'n lisosoom saamsmelt om wat 'n outolisosoom genoem word, te vorm, waar pH-afhanklike degradasie plaasvind. Die tempo van proteïenafbraak deur die proses word die outofagiese vloed genoem, en 'n verhoogde outofagiese vloed kan voordelig wees, veral aangesien daar getoon is dat outofagie-aktiwiteit afneem tydens veroudering. Toenemende outofagie-aktiwiteit is die fokus van baie studies om verbeterde behandelingstrategieë teen neurodegeneratiewe siektes te vind, veral dié wat met veroudering verband hou.

Evaluering van die outofagiese vloed

Die LSM780 konfokale mikroskoop met ELYRA PS1 superresolusie platforms in die CAF Mikroskopie eenheid (voorheen Fluoressensie Mikroskopie eenheid) is gebruik om 'n sleutelkomponent van volwasse outofagosome te visualiseer, naamlik mikrotubule-geassosieerde proteïen-1 ligte ketting of LC3 proteïen. Hierdie proteïen kan gebruik word om verskeie parameters van die outofagiese vloed te meet. Hier het 'n etiketteringstrategie waarvolgens LC3 geel in outofagosome en rooi in outolisosome met konfokale mikroskopie vertoon het aan die lig gebring dat spermidienbehandeling by hoë (10 µM) en lae (1 µM) konsentrasies die aantal outolisosome aansienlik verhoog het, maar slegs hoë konsentrasies spermidien het die getal verhoog. van outofagosome (Fig.8). Die omsettyd van die hele outofagiese poel is verminder van 2 uur in kontroleselle tot 0.64 uur in die lae-konsentrasie-behandelingsgroep en tot 1.21 uur in die hoë-konsentrasie-behandelingsgroep. Hierdie resultate dui daarop dat daar 'n konsentrasie-afhanklike toename in die outofagiese vloed is in reaksie op spermidien.

Korrelatiewe mikroskopie om die outofagiese vakuole te bestudeer

Met behulp van transmissie-elektronmikroskopie, wat superieure resolusie bied as konfokale mikroskopie, is outofagiese vakuoolgroottes gemeet en gevind dat dit verminder is in spermidienbehandelingsgroepe. Met elektronmikroskopie is outofagosome en outolisosome egter ononderskeibaar (daarom slegs na verwys as outofagiese vakuole), wat akkurate ontleding van veranderinge in vakuolêre grootte in die konteks van die outofagiese vloed voorkom. Om outofagosome van outolisosome in die 3D sellulêre ultrastruktuur te onderskei, moes 'n CLEM-werkvloei geïmplementeer word. Gestruktureerde beligtingsmikroskopie (SIM), wat die resolusie van fluoressensiebeelding verbeter, is die eerste keer gebruik om die outofagosome te lokaliseer. Ten tyde van hierdie studie was 3D elektronmikroskopie nie by die Universiteit Stellenbosch beskikbaar nie, dus is monsters vasgemaak, voorberei vir elektronmikroskopie en dan na die Elektronmikroskopielaboratorium in die Wetenskaptegnologieplatform van die Francis Crick Instituut in Londen gestuur vir verkryging van elektrone mikroskopie mikrograwe in 3D op 'n gefokusde-ioon-straal skandeer-elektronmikroskoop (FIB-SEM). Die navorsingspan van prof Loos het toe die superresolusie-mikroskopie-resultate wat in CAF verkry is, gebruik om spesifiek die outofagosome te lokaliseer in die elektronmikrograwe wat in die Verenigde Koninkryk verkry is (Fig. 9). Na lokalisering moes die outofagosome met die hand deur die hele stapel elektronmikroskopiebeelde gesegmenteer word om 'n 3D-model van die outofagosome in hul hele volume te verskaf voordat morfometriese analise uitgevoer kon word (Fig. 10). Een van die hoofrolspelers in hierdie proses van korrelasie, segmentering en analise was dr Jurgen Kriel, wat nou die operateur van die ThermoFisher VolumeScope SEM by Tygerberg Mediese Kampus is, maar Nicola Heathcote, destyds 'n honneursstudent en nou 'n PhD-student. in die Loos-laboratorium, het ook 'n belangrike rol gespeel.

Die resultate van CLEM het aan die lig gebring dat spermidien 'n beduidende rol gespeel het in grootteregulering van die outofagosome, wat verband hou met effektiewe vragopruiming. Die volume en oppervlakarea van outofagosome is verhoog in die lae-konsentrasie behandelde selle, terwyl hierdie parameters in die hoë-konsentrasie behandelingsgroep verminder is. Hierdie resultate het die konsentrasie-afhanklike effek van spermidien bevestig, wat verdere studie verdien, en het verder die vereiste vir hoë-presisie-identifikasie van sellulêre organelle in elektronmikrograwe beklemtoon deur die identifikasiestrategieë wat moontlik gemaak word met fluoressensiemetodes en daaropvolgende korrelasie.

Effekte van spermidien op die sellulêre vervoerproteïene

Outofagosoomvervoer maak staat op die vervoerstelsels van die sel om assosiasie met lisosome vir samesmelting te akkommodeer. Tubulien, veral in 'n asetileerde toestand, is een van die steierproteïene wat 'n vervoermodus vir organelle soos outofagosome bied en word struktureel die effektiefste bestudeer met superresolusietegnieke as gevolg van sy fyn struktuur. Deur beide superresolusie-mikroskopieplatforms, naamlik SIM en stogastiese optiese rekonstruksiemikroskopie (STORM), op die neuronale selmodelle te gebruik, is waargeneem dat tubuliensein en -digtheid toegeneem het in parakwat-geaffekteerde selle wat met spermidien behandel is (Fig. 11). Uit metings in muisbreine het dit egter geblyk dat die uitwerking van spermidien- en parakwatbehandelings op asetileerde tubulienvlakke streekspesifiek was. Die lokalisering en struktuur van asetileerde tubulien is nie in die weefselmonsters bepaal nie, maar die resultate wat in die selle verkry is, is motivering vir verdere studie oor die effekte van spermidien op vervoerproteïene in lewende modelle.

Akkurate metings van amyloïedvoorloperproteïenakkumulasie en opruiming

Visualisering en akkurate kwantifisering van proteïenophoping en -opruiming verskaf sterk bewyse van die doeltreffendheid van terapeutiese middels vir neurodegeneratiewe siektes. Hier is die STORM superresolusie metode gebruik om die aantal APP aggregate sowel as hul relatiewe groottes te bepaal. Met konvensionele konfokale mikroskopie kan strukture kleiner as 200 nm nie akkuraat gemeet word nie, terwyl SIM slegs akkurate metings tot 100 nm toelaat. Met STORM kan resolusie na verskeie nanometers verbeter word. Vir hierdie metode word monsters gewoonlik in 'n buffer gevisualiseer wat die fluoressensiemolekules toelaat om te knip eerder as om voortdurend hul fluoressensie saam met naburige fluorofore uit te straal. Die flikker-effek stel die navorser in staat om, deur sagteware-algoritmes, die enkele fluoressensiemolekules wat vir proteïenetikettering gebruik word, te lokaliseer tot subresolusie-presisie en om die fluoressensiebeeld vanaf die kaart van gelokaliseerde fluorofore te rekonstitueer in plaas van hul werklike emissie.

APP-ooruitdrukking is geïnduseer deur toediening van bottersuur (BA) vir 24 uur en 48 uur onderskeidelik. APP-klusters het gewissel van 6 tot 50 nm2, met 'n oorvloed van APP-klusters van 6 tot 10 nm2 op 24 uur. Die aantal APP-klusters op die 48-uur tydpunt is aansienlik verhoog vir alle groottes. In die teenwoordigheid van spermidien, was opruiming van APP-klusters duidelik, veral in die verminderde aantal trosse 6-25 nm2 op die 24-uur tydpunt, terwyl APP-kluster-opruiming van alle groottes op 48 uur sigbaar was (Fig.12). Hierdie studie wys duidelik visueel hoe behandeling met spermidien proteïenakkumulasie verminder en opruiming van sulke aggregate bemiddel, wat die potensiaal daarvan in die behandeling en voorkoming van siektes soos Alzheimer se siekte openbaar.

Gevorderde mikroskopie tegnieke beskikbaar vir almal

Die korrelatiewe werk van dr Lumkwana was die voorloper vir die verkryging van ThermoFisher Apreo Volumescope SEM vir die Universiteit Stellenbosch. Die Volumescope, wat nou deur SAF by die Tygerberg Mediese Kampus gehuisves word, word bedryf deur Dr Kriel wat nou saamwerk met die span van die Elektronmikroskopielaboratorium van die Francis Crick Instituut om te verseker dat metodes hier voldoende geïmplementeer word. Die beskikbaarheid van volumetriese elektronmikroskopie aan die Universiteit Stellenbosch bied geleenthede vir navorsers in Suid-Afrika om subsellulêre struktuur met baie hoër presisie te bestudeer as wat voorheen moontlik was.

Die toepassing van superresolusietegnieke is nie in dieselfde mate in Suid-Afrika aangeneem as in gebiede soos Europa en die Verenigde State van Amerika nie. Terwyl SIM nie gespesialiseerde monstervoorbereiding vereis nie, slegs optimale sein vanaf fluoresserende merkers, vereis STORM 'n geoptimaliseerde omgewing vir die fluorofore om te knip. Dit het bewys dat dit nogal uitdagend is, wat die gebruik van STORM beperk. Hierdie studie wys hoe superresolusiemikroskopie, in korrelasie met elektronmikroskopie, nie net nuwe inligting kan openbaar nie, maar ook 'n manier kan bied vir strukturele metings van baie hoër akkuraatheid as konfokale mikroskopie.