Konfokale mikroskopie is een van die hoë-resolusie beelding tegnologieë wat die minste inmeng en daarom baie kragtig in die visualisering van dinamiese prosesse in lewende selle. Dit maak ook voorsiening vir die beeld van verskillende vlakke van 'n monster en elimineer alle buite-fokus lig in die proses vir beter resolusie in al die dimensies. Die verkryging van wat 'n 'Z-stapel' genoem word op hierdie manier word 'optiese snit' genoem, en tydens naverwerking kan hierdie beelde gerekonstrueer word om die navorser in staat te stel om die monster in drie dimensies te visualiseer. Die verkryging van 'n Z-stapel is dus in wese 'n tipe virtuele snit wat herhalend uitgevoer kan word. Dit is in teenstelling met die eenmalige fisiese snit van 'n monster wat byvoorbeeld plaasvind wanneer beelding met 'n elektronmikroskoop vir driedimensionele beeldrekonstruksie plaasvind.
Die Zeiss LSM780 ELYRA PS1-konfokale mikroskoop in die Sentrale Analitiese Fasiliteite se Fluoressensiemikroskopie-eenheid is oor die afgelope nege jaar op groot skaal deur verskeie studente gebruik vir dinamiese prosesse, soos selmigrasie en chemotaksis, selstres en seldood, kernvervoer en vele meer. Mitochondriale dinamika was 'n spesifieke fokus van die neuronavorsingsgroep onder leiding van prof Ben Loos van die Departement Fisiologiese Wetenskappe. Wanneer die mitochondriale prosesse, soos splitsing en samesmelting, benadeel word, is dit gewoonlik een van die molekulêre aanduidings vir die aanvang van neurodegeneratiewe afwykings soos Alzheimers of Parkinson se siekte.
Prof Loos het in 2015 'n samewerking met prof Thomas Niesler se groep by die Departement Elektroniese en Elektriese Ingenieurswese begin met die oog op die ontwikkeling van meer geoutomatiseerde, hoë-deurset-instrumente vir driedimensionele beeldvisualisering en -analise. As deel van hierdie samewerking en sy PhD-navorsing oor virtuele werklikheidsgeleide visualisering en kwantifisering van mikroskopiedata in drie dimensies, het dr Rensu Theart die Mitochondrial Event Localiser (MEL)-instrument ontwikkel om die dinamika van die driedimensionele mitochondriale netwerk te ondersoek.
Hoe werk die Mitochondrial Event Localiser instrument?
Die werkvloei vereis eerstens dat die Z-stapel-data vooraf verwerk word om die beste moontlike kwaliteit en konsekwentheid tussen beeldrame van die tydsverloop te verseker. Deur 'n proses genaamd 'hysteresis thresholding',word agtergrondsein van elke raam verwyder, wat 'n gefiltreerde binariseerde beeld tot gevolg het. Na kompensasie vir enige geringe beweging van die mitochondria, is skikkings van hierdie stapels gereed vir outomatiese verwerking.
Die voorbereide skikkings is die invoer na die MEL outomatiese beeldanalise-algoritme wat die data sal ontleed en 'n lys van mitochondriale gebeurtenis-liggings sal produseer. Dit sal soek na potensiële plekke van (i) samesmelting, waardeur twee kleiner fragmente van mitochondria 'n groter enkele struktuur in 'n daaropvolgende raam vorm, (ii) splitsing, waardeur 'n groot mitochondriale fragment skei in twee kleiner fragmente, en (iii) depolarisasie, waardeur 'n fragment in opeenvolgende rame verdwyn as gevolg van 'n verlies aan fluoressensie sein. Deur 'n proses genaamd 'heen-en-weer-struktuurpassing', word baie liggings van hierdie gebeurtenisse geïdentifiseer en gelokaliseer in die driedimensionele tydsverloop. Die uitset wat deur die MEL-instrument gegenereer word, bestaan uit die insette Z-stapels met gesuperponeerde kleurgekodeerde gebeurtenislokalisasies.
Aangesien die verwerkingstappe vals positiewe resultate kan produseer, het die groep selfs verder gegaan om 'n valideringsinstrument te ontwikkel wat 'n menslike deskundige in staat stel om elke gebeurtenis individueel te ondersoek deur die uitgesnyde beeld van die gebeurtenis wat deur die MEL-nutsding geïdentifiseer is, langs binêre beelde van die rame te vertoon voor en net na die geleentheid. Die rame is verder bo-opgelê, en die veranderde fragmente is kleurgekodeer om die ondersoeker te help om te bevestig dat die gebeurtenis wel korrek geïdentifiseer is.
In 'n onlangse publikasie in die akademiese joernaal PLOS One het die groep getoon dat die aantal splyting-, samesmeltings- en depolarisasiegebeure in gesonde soogdierkontroleselle in ewewig gehou is teen 'n gemiddelde verhouding van 9.3/7.2/2.3 gebeurtenisse. Wanneer dit egter met peroksied behandel is om die mitochondriale netwerk te versteur, het die balans duidelik na samesmelting verskuif teen 'n verhouding van 15/6/3. Dit is waargeneem dat dit vinnig tot 'n nuwe ewewig (6.2/6.4/3.4) gevestig is wat meer vergelykbaar was met die kontroleselle.
Wat kan hierdie tipe resultate vir navorsers sê?
Die mitochondriale netwerk en morfologiese veranderinge is so dinamies dat die interpretasie van kwalitatiewe data en die beperkte kwantitatiewe data wat tans beskikbaar is rede tot debat onder navorsers is. Sommige glo dat 'n hoogs-genetwerkte mitochondriale struktuur 'n aanduiding is van verbeterde sellulêre gesondheid, terwyl 'n gefragmenteerde netwerk 'n sel aandui wat onder erge stres verkeer, wat nadelig is. Ander beweer dat 'n hoogs-genetwerkte struktuur slegs die eerste teken van 'n stresreaksie is en dat fragmentasie dui op verhoogde sellulêre beheer deur hierdie aanpassingsmeganismes, om die verwydering van disfunksionele mitochondria te dryf. Aangesien die MEL dit moontlik maak om die ontwikkeling en rigting van hierdie prosesse na te spoor, hetsy na splitsing, samesmelting of geen verandering, met ander woorde om in ewewig te wees, sal dit 'n baie beter begrip van hierdie konteks moontlik maak. Gevolglik kan die waarheid van die omstandighede afhang, en 'n eenvoudige waarneming van die netwerk sonder inagneming van die dinamiese gedrag kan tot groot waninterpretasies lei. Splyting skei nie net mitochondria wat uit die netwerk verwyder moet word nie, maar skei ook mitochondria wat elders in die sel vervoer moet word, byvoorbeeld na die sinapse in neurone. Dit kan 'n lang afstand wees, meer as 'n meter vir sommige neurone. In teenstelling hiermee, wanneer mitochondria teen degradasie beskerm moet word, kan samesmelting die voorkeurreaksie in die sel wees aangesien materiaal gedeel en verdun word, en asemhaling oor 'n groter netwerk kan plaasvind.
Die akkurate kwantifisering van die verband tussen splitsing, samesmelting en depolarisasie in 'n driedimensionele sellulêre konteks sal navorsers in staat stel om die ewewig onder verskeie toestande beter te beskryf en 'n afwyking van hierdie ewewig en die gevolglike effekte te identifiseer. Dit sal besondere toepassing hê in die studie van neurodegeneratiewe siektes en het geweldige potensiaal om nie net navorsers te help met die ontwikkeling van behandelings wat mitochondriale funksie teiken nie, maar ook om as 'n diagnostiese hulpmiddel vir die vroeë opsporing van hierdie siektes te dien. Tesame met kragtige hoë-deurset-platforms, kan die MEL 'n nuwe standaard word, wat 'n heeltemal nuwe kategorisering van selle moontlik maak volgens hul splitsings- en samesmeltingsgedrag onder gesonde en siek toestande. Aangesien die mitochondria ook die verbinding van sellulêre lot is, met ander woorde lewe of dood (apoptose), kan hierdie toepassing ook van waarde wees in die ontwikkeling van kankermedisyne, waarin mislukte mitochondria verlang word.
Artikel gepubliseer in the SAF Jaarverslag 2020/2021
