Elektronmikroskopie (EM) is lank reeds 'n noodsaaklike hulpmiddel vir navorsers om die ultrastrukturele detail van selle en weefsels op nanoskaal resolusie te assesseer. Alhoewel impakvol, konvensionele EM-benaderings slegs inligting oordra in 'n tweedimensionele ruimte, wat die vermoë beperk om die ware strukturele organisasie van biologiese materiaal te assesseer. Van die manier waarop verbindings tussen individuele neurone gevorm word tot hoe bakterieë plantwortels infiltreer, kan sekere insigte eers verkry word sodra materiaal in 'n driedimensionele ruimte geassesseer is. Serial block-face (SBF) skandeerelektronmikroskopie (SEM) is 'n kragtige volumetriese EM-modaliteit wat sulke driedimensionele verkryging van inligting moontlik maak en is aan die einde van 2020 vir die heel eerste keer deur CAF aan navorsers in Afrika beskikbaar gestel.

​

Die ThermoFisher Apreo Volumescope is een van die mees onlangse en gevorderde volumetriese SEM's wat vandag beskikbaar is. Die Apreo Volumescope, wat by die Tygerberg Mediese Kampus gehuisves is, is die enigste so 'n mikroskoop op die Afrika-kontinent en maak die deur oop vir baie nuwe weë van navorsing benewens die verbetering van huidige deurlopende navorsing.

Hier verskaf ons die vordering wat gemaak is in volumetriese EM binne die Suid-Afrikaanse navorsingslandskap om die nuwe insigte wat deur SBF-SEM bereik kan word ten toon te stel.

In skrille kontras met die breinweefsel waarvoor SBF-SEM oorspronklik ontwerp is, het die eerste Suid-Afrikaanse studie wat van die Apreo Volumescope gebruik gemaak het gefokus op die karakterisering van melanienbevattende selle in akkedisvel om te verstaan hoe hulle in staat is om kleur te verander onder verskillende weerstoestande. Die vraag wat deur dr Fredericco Masetti en prof Susana Clusella-Trullas gestel is, was of die pigment-bevattende strukture, waarna verwys word as melanofore, tussen individuele velselle gedeel is en of hierdie uitsteeksels binne die grense van enkelselle gebly het. Die volumetriese data het aan die lig gebring dat die swart gepigmenteerde strukture (Figuur 22) vervat gebly het binne die grense van afsonderlike areas binne die weefselmonster, met melanofore wat 'tussen' ander selle uitsteek eerder as om onder hulle gedeel te word (vertoon as pers weergegee strukture in Figuur 22 ).

Deur selfs verder oor dissiplines heen te beweeg, is die Volumescope ook gebruik om patogeeninteraksie met plantmateriaal te verstaan. As deel van PhD-kandidaat Alno Carstens se navorsing (onder leiding van prof Lydia Joubert en prof Gideon Wolfaardt), het aanvanklike SEM-analise bakteriese assosiasie op die buitenste membraan van sekere plantwortels aan die lig gebring (Figuur 23 A). Dit is egter nie bekend of hierdie bakterieë in staat is om die plantselwand binne te dring en indien wel, in watter mate nie. SBF-SEM het voorsiening gemaak vir die visualisering van beide plantmateriaal en bakteriese assosiasie. Opmerklik is dat 'n enkele deursnee deur die monster (Figuur 23 B) nie die mate van bakteriese assosiasie akkuraat sou weergee nie. Na daaropvolgende beeldanalise en grootte-uitsluiting-gebaseerde drempelwaarde (Figuur 23 C, D), is die verspreiding van bakteriese assosiasie egter sigbaar gemaak, met slegs 'n klein aantal bakterieë wat die plant kon binnedring.

Alhoewel die hoofdoel van SBF-SEM is om strukture van belang uit te beeld, kan dit ook as 'n verkennende hulpmiddel gebruik word. Driedimensionele selkultuurmodelle is baie voordelig vir kankernavorsers, aangesien hulle tumorgroei in die menslike mikro-omgewing nader naboots as enkelselle in 'n petriskottel. 'n Beperkende faktor in die ultrastrukturele analise van kankersferoïede is egter om streke op verskillende dieptes te identifiseer en akkurate vergelykings te tref tussen die buitenste prolifererende laag en die binneste nekrotiese kompartement. As deel van MSc-student Kim Frederick se proefskrif (onder leiding van prof Ben Loos), kon streeksvergelykings in die sitosoliese ultrastruktuur in breinkankersferoïede (Figuur 24 A) aan beide die binneste (Figuur 24 B) en die buitekant (Figuur 24 C) gemaak word. ) laag in opeenvolgende afdelings. Dit het moontlik gemaak vir die identifikasie en vergelyking in die volume van nekrotiese/dooie streke tussen kontrole en behandelde monsters (Figuur 24 D) om die potensiële terapeutiese uitkomste van nuwe verbindings te bestudeer.

Connectomics is die studieveld wat toegewy is aan die kartering van neuronale stroombane om spesifieke weë wat met gedrag geassosieer word te identifiseer of om vas te stel hoe neuronale interaksies onder patologiese toestande beskadig word. Alhoewel 'n gebied van groot vooruitgang in die res van die wêreld is, was sulke navorsing nog nooit voorheen in Suid-Afrika moontlik nie. Dr Kriel het sedert die verkryging van die Apreo Volumescope nou saam met prof Carine Smith gewerk om konneksie-navorsing in Suid-Afrika moontlik te maak. Deur sebravis as 'n model-organisme te gebruik, kon hulle verbind neurone in 'n subset van sebravis breinweefsel segmenteer. Tans word pogings aangewend om hierdie segmentering outomaties deur diepleergebaseerde benaderings uit te voer. Figuur 25 toon die kartering van 'n gekoppelde subset van neurone en kwantifisering van die netwerkverbindings in 'n enkele stroombaan.

Die Sentrale Analitiese Fasiliteite (SAF) Mikroskopie-eenheid bly die enigste mikroskopie-eenheid in Suid-Afrika wat toegewy is aan die bevordering van multimodale beelding. Alhoewel 2D-korrelatiewe lig- en elektronmikroskopie (CLEM) nou 'n vaartbelynde diens is, is 3D CLEM lankal buite bereik vir Suid-Afrikaanse navorsers. CAF het nou suksesvol 'n 3D CLEM-werkvloei opgestel om konfokale en volumetriese EM-datastelle te kombineer. Hierdie benadering help tans aansteeklike siekte-navorsers dr Caroline Beltran en prof Gerhard Walzl om die begrip van Mycobacterium tuberculosis (mTB) patofisiologie te verbeter, spesifiek in die vorming van granulome. Bestaan uit 'n verskeidenheid immuunselle, die assessering van die verspreiding van mTB-geïnfekteerde selle in granulome word moontlik gemaak deur genetiese modifikasie van mTB om 'n fluoresserende proteïen te produseer. Beeld B in Figuur 26 toon 'n konfokale mikroskopie beeldweergawe van granuloom in muis longweefsel, met die mTB in die rooi fluoressensie kanaal. Alhoewel dit die gekombineerde visualisering van veelvuldige immuunselmerkers moontlik maak, kan die individuele bakterieë binne elke besmette sel nie voldoende deur ligmikroskopie alleen bestudeer word nie. Deur 'n reeks noukeurige monstervoorbereidingsstappe is SBF-SEM op 'n enkele granuloom uitgevoer nadat dit deur middel van konfokale mikroskopie geïdentifiseer is (Figuur 26 A – E). Die oorlegging van hierdie twee datastelle het 'n duidelike aanduiding gegee van waar die bakterieë geleë was (Figuur 26 E – G) en het voorsiening gemaak vir die segmentering van individuele bakterieë binne geïnfekteerde makrofage. Verder kan die meerkernige aard van hierdie selle ook meer akkuraat bestudeer word, en voorlopige data dui daarop dat hierdie besmette selle 'n georganiseerde netwerk vorm (Figuur 26 G).

Figuur 26 A) Konfokale teëlskandering van muislongvibrasie-afdeling. B) Weergawe van konfokale beeldstapel (60 x vergroting). C) Plat harsinbedding en fyn sny van streek van belang (ROI). D) SBF-SEM oorsig beeld van die hele ROI tydens verkryging. E) Oorleg van konfokale en SBF-SEM beelde, met 'n hoë-resolusie ROI in rooi uiteengesit. F) Streek positief geïdentifiseer om bakterieë te bevat. G) Rendering van besmette selle. H) Gekombineerde oppervlakweergawe van 'n enkele makrofaag (groen) het veelvuldige kerne (grys) en mTB (rooi) bevat.

Die data wat hier aangebied word, is 'n merkwaardige vertoning van hoe navorsers van verskeie dissiplines waardevolle insigte kan verkry deur volumetriese EM. Alhoewel baie vordering gemaak is, is die toepassing van SBF-SEM nog in sy kinderskoene in Suid-Afrika. Daar word gehoop dat met verdere uitbreiding van die vaardighede en kundigheid wat nodig is om SBF-SEM-datastelle te bekom en te verwerk, nuwe ontdekkings gemaak kan word om die weg te baan vir vooruitgang in kritieke sektore wat wissel van gesondheidsorg tot landbou.

 Figure waarna verwys word kan in die Jaarverslag gesien word.

Verwysingslys